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檢驗檢測

做qPCR,不要鉆進“唯Ct值”的牛角尖!

瀏覽量: 4698   發表時間: 2021-01-20 16:22
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 熒光定量PCR(qPCR)是目前病原檢測領域使用最為廣泛的核酸檢測方法(PCR檢測技術概述)。尤其是非洲豬瘟和新冠發生后,qPCR檢測得到了極大的普及,對于剛剛進入qPCR檢測領域的人,很容易鉆入了“唯Ct值”的牛角尖,今天我們就聊聊qPCR中的Ct值。



一、Ct值的基本概念

   1、什么是Ct值

   閾值循環數 Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值,熒光信號大于熒光閾值時PCR循環數。儀器軟件通常將第3-15個循環的熒光值設為基線(baseline),是由于測量的偶然誤差引起的。閾值(threshold)一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調節。高于閾值的熒光信號被認為是真實的信號,用于定義Ct值。Ct會受到閾值的影響,每次試驗由于樣品和儀器的不同會導致基線不同,進而影響閾值和Ct值。

    模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在一定線性關系,起始模板量濃度越高,Ct值越??;起始模板量濃度越低,Ct值越大。PCR循環在到達Ct值所在的循環數時,剛剛進入真正的指數擴增期(對數期),此時微小誤差尚未放大,Ct值的重現性較好,即相同含量的初始模板,得到的Ct值是相對穩定的。

    Ct值不是恒定不變的,可以受到不同樣品、不同儀器的影響,即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍,Ct值也會存在差異。

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(圖片來網絡,版權歸原作者所有)


    2、與Ct值有關的參數

    標準曲線Standard curve:模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數的對數,縱坐標代Ct值。

    相關系數Correlation coefficient (R^2) :反映了標準曲線的線性,通常要求>0.99。

    擴增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%,是由于PCR反應中存在抑制因素;而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。

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    斜率Slope :當擴增效率為100%時斜率為-3.32,當90%-110%時的斜率為-3.58 ~ -3.10。

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  3、Ct值與模板拷貝數的關系

    理想情況下,qPCR的模板經過一定的循環數進行指數擴增,擴增循環數和產物量之間的關系是:擴增產物量Cn=起始模板量C1×(1+擴增效率E)^循環數n。但是由于E通常無法達到100%,并且在擴增的后期,擴增效率會逐漸降低,只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n,即Ct值差1,初始濃度差2倍。

    由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定。這是目前最常用的qPCR定量的方法,即用已知濃度的標準品與未知濃度樣品同時擴增,將未知濃度樣品的Ct值代入該標準曲線獲得未知樣品濃度。分析定量時,一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量結果的不準確。標準曲線需滿足:E:90%~110%,R^2≥0.99,斜率-3.58 ~ -3.10。同時定量標準品的量值需要準確可靠。

    用qPCR進行定量,理論上可行,實際上很難獲得準確的定量結果。



二、關于qPCR中Ct值的幾點思考

   1、Ct值能否直接換算成模板拷貝數?

    通過制作標準曲線(E:90%~110%,R^2≥0.99,斜率-3.58 ~ -3.10)的方法可以獲得未知樣品的初始模板拷貝數,前提是需要樣品與標準品同時擴增,定量標準品需要使用標準物質等定量準確的物質(OD260/280換算的的拷貝數誤差很大),即使如此定值結果仍存在一定的誤差。


    2.熒光定量PCR是否為定量方法?

    雖然名字里有“定量”,但是qPCR的間接定量方式又復雜,又受很多因素影響,又不準確,在計量領域是不被認可的。目前的核酸檢測方法中只有數字PCR是真正的定量檢測方法,其余的都是定性檢測方法。


    3、Ct值能否作為評價qPCR試劑盒的指標?

    qPCR試劑的評價需要從分析敏感性(最低檢測限),分析特異性(交叉反應),重復性(精密度),診斷敏感性,診斷特異性等多個指標去衡量 (診斷試劑評價系列2-核酸檢測方法(更正),診斷試劑評價系列4-最低檢測限,你做對了嗎?)。僅憑Ct值的高低去判斷一個qPCR試劑盒的優劣太片面,不同試劑盒的Ct值不具有可比性。有些試劑盒采取先進行幾個循環的預擴增,再進行正式循環的做法就是為了使Ct值看起來更低。


     4、能否通過增加擴增循環數來增加試劑盒的敏感性?

    這里指的是大部分的qPCR試劑盒的循環數為40個或45個,我們能否在不改變試劑盒的設計的前提下,僅通過將40個循環增加到45個循環,或是將臨界值由38提高到40,或者由40提高到45的方式來提高試劑盒的敏感性呢?

    4.1 從原理上解釋

    理論上,假設初始模板量為1個拷貝,酶的擴增效率100%,到達最大閾值約需要35個循環,因此業內通常認為qPCR的有效線性范圍為Ct:15-35。通常酶的擴增效率無法達到100%,達到1個拷貝模板的循環數可能會達到38或更高,如下圖我用qPCR和數字PCR測到了1拷貝模板對應的Ct值為37.91。當酶的效率更低或者存在抑制劑時,檢測到1拷貝模板的循環數的Ct值可能會更高。

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    當初始模板核酸濃度≤1 copies/μL時,這時的影響因素不光是你能否檢測到,還取決于你每次能取到模板的概率。因為在低濃度下,每次取到模板的概率是服從泊松分布的。不明白的可以看看(診斷試劑評價系列4-最低檢測限,你做對了嗎?

(At very low copy numbers,under 20 copies per tube ,the random variation due to sampling error(poisson's error law)become significant .--《MIQE&qPCR》4ed)


     4.2 qPCR循環數試驗

    模板濃度:將標準物質稀釋為0.5,1,2,3,4,5 copies/μL,模板上樣量2 μL,每個濃度10次重復。

    擴增體系:使用相同的引物探針和擴增體系進行擴增,擴增體系體積為20 μL。該擴增體系的R^2=0.997,E=92.57%,斜率-3.51。

    循環數:分別進行40個循環和45個循環,其他條件完全一致。

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    試驗結果:

    (1)最低檢測限:40個循環和45個循環的最低檢測限均為3 copies/μL ;

    (2)低濃度模板的陽性檢出率:2,1,0.5 copies/μL的陽性檢出率完全相同,分別為90%,70%,60%;

    (3)平均值,SD,CV:將兩者平均值做配對T檢驗的P值為0.002,差異極顯著,45個循環的平均值普遍比40個循環的平均值高0.35-1.22,而SD和CV均無顯著性差異。

    (4)Ct值40以上的結果:僅有一個值為40.53。


    試驗結論:

    通過增加循環數不能提高試劑本身的最低檢測限和對低濃度樣品的檢出率。循環數增加是否會增加非特異擴增的概率,本次試驗未進行驗證。



三、再多說幾句

1.每個qPCR試劑盒在上市前應該按照行業統一的標準進行各種指標的系統評估,試劑盒生產廠家應該提供這些參數供客戶進行選擇和驗證。檢測實驗室也應該具備對試劑盒進行性能驗證的能力。

2.一個qPCR試劑盒的核心是引物探針設計、酶、反應體系和最優的反應條件,試劑盒生產廠家應該從根本上去改進自己的試劑盒而不是做一些文字游戲。

3.對于檢測來說,qPCR試劑盒只是其中的一個環節,如果想得到可靠的檢測結果還需要對采樣、運輸、保存、處理、提取和擴增的每個環節進行質量控制(檢測全流程質量控制)。實驗室的檢測人員也不要抱有解決了qPCR試劑盒的問題就解決了檢測中所有問題的幻想。


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