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    檢驗檢測

    實時熒光定量 PCR:了解 Ct

    瀏覽量: 1272   發(fā)表時間: 2021-08-02 09:21
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    簡介

    實時熒光定量 PCR,又稱為定量 PCR 或 qPCR,可以為測定樣品中的靶標序列或基因數(shù)量提供簡單、簡潔的方法。該方法高度簡化,有時會忽略實現(xiàn)方法方面的關鍵因素,因此導致出現(xiàn)問題。本文將重點強調(diào)設置和評估實時熒光定量 PCR 反應時必須考慮的這些因素。




     圖1.實時熒光定量 PCR 數(shù)據(jù)的圖形表示。Rn 是報告基團染料的熒光除以惰性參比染料的熒光的比值;即,Rn 是歸一化到 Applied Biosystems? ROX? 染料的熒光信號的報告基團信號。(A) 在此視圖中,Rn 根據(jù) PCR 循環(huán)數(shù)進行繪制。(B) ΔRn 為 Rn 減去基線;ΔRn 根據(jù) PCR 循環(huán)數(shù)進行繪制。(C) 擴增圖顯示對數(shù) (Δrn) 隨 PCR 循環(huán)數(shù)的變化。



    可能影響 Ct 的因素

    Ct(閾值循環(huán))是擴增曲線與閾值線的交叉點(圖 1B)。它是 PCR 反應中靶標濃度的相對測量。除靶標濃度之外,還有很多因素會影響 Ct 的絕對值。我們將要討論最常見的可能影響 Ct 值的非模板依賴性因素,并描述如何評估實時熒光定量 PCR 反應的性能。

    上述圖 1 顯示實時反應擴增圖的幾個參數(shù)。圖 1B 中的指數(shù)期對應于圖 1C 中的線性期。在圖 1C 中,閾值必須設在擴增圖的線性期中。C值隨模板量減少而增加。然而,反應混合物或儀器中的任何干擾,只要能影響與 Ct 計算相關的熒光測定,都會使 C值產(chǎn)生非模板依賴性的變化。因此,在不同條件下或用不同試劑進行的 PCR 反應產(chǎn)生的 C值不可以直接進行比較。 

    圖 2.  在使用具有相同 ROX 水平的兩種預混液的一次檢測中獲得的原始熒光數(shù)據(jù)。信號差異是由預混液的成分造成的。使用 Applied Biosystems? VIC?/MGB 探針在 Applied Biosystems? 7900HT 快速實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)上執(zhí)行此反應。x 軸顯示熒光基團的的發(fā)射波長,y 軸顯示發(fā)射強度。

    預混液成分的影響

    任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素的影響,比如溶液的 pH 值和鹽濃度。圖 2 顯示某個 Applied Biosystems? TaqMan? 探針在兩種不同預混液背景下的原始熒光數(shù)據(jù)。請注意,盡管兩組反應的靶標、探針和 ROX 染料濃度都相同,預混液 A 中的熒光強度更高。

    因此,如圖 3 所示,產(chǎn)生的 ΔRn 值也不同。請注意,熒光信號基線屬于非模板依賴性因素,兩種預混液的基線是不同的(圖 3A)。Ct 值的變化并沒有反映出反應系統(tǒng)的整體性能(圖 3B)。靈敏度相當?shù)念A混液產(chǎn)生的 C絕對值可能不同。

    圖 3.使用預混液 A 和預混液 B 在等量的人類 gDNA 中進行 RNase P 擴增。(A) Rn 根據(jù)循環(huán)數(shù)進行繪制,并且顯示兩個反應的基線。(B) 對數(shù) (ΔRn) 根據(jù)循環(huán)數(shù)進行繪制。兩種預混液的閾值(綠線)設定為相同水平。對于相同濃度的靶標而言,預混液 B 的 Ct 值 (CtB) 早于預混液 A 的相應值 (CtA),表明預混液 B 的基線較低。使用 Applied Biosystems? 7500 實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)執(zhí)行所有擴增。

    ROX 惰性參比染料

    Rn 值是由 Applied Biosystems? FAM? 染料的熒光除以 ROX 染料的熒光而計算得出的比率。因此,假定 FAM 染料產(chǎn)生的熒光信號保持不變,ROX 染料量越少,產(chǎn)生的 Rn 值就越高。這將導致 Rn 基線上升,以及隨后 ΔRn 的減少和 Ct 值的變化。通過降低 ROX 染料水平而得到不同 Ct 值,沒有對反應的真實靈敏度產(chǎn)生任何影響,卻有著意想不到的后果。如圖 4 所示,降低 ROX 染料的濃度可能會增加 C值的標準差。標準差越大,分辨靶濃度之間的細微區(qū)別的可信度就越低(參加下文的精確度一節(jié))。

    圖 4.  使用包含 3 種不同濃度的 ROX 染料的預混液對 TGF-β 進行擴增。顯示 (A) Ct 值和 (B) 標準差隨 ROX 染料濃度的變化。降低 ROX 染料濃度導致 Ct 出現(xiàn)得更早,但是會增大標準差。使用 Applied Biosystems 7500 實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)執(zhí)行所有擴增。

    PCR 反應的效率

    PCR 反應的效率也會影響 Ct 值。在低效率條件下進行連續(xù)稀釋擴增,與高效率條件下相比,可能會產(chǎn)生斜率不同的標準曲線。在圖 5 中,兩個樣品(X 和 Y)分別在低效率和高效率條件下擴增,在靶濃度相同的條件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中,盡管高效率條件(圖 5 中的藍色曲線)在高濃度時產(chǎn)生的 C值更晚,但它在靶濃度低時卻更為靈敏。PCR 效率取決于實驗、預混液性能和樣品質(zhì)量。通常情況下,反應效率在 90-110% 之間都是可以接受的。另一方面,假定所有其他因素如儀器、試劑和實驗完全相同, 該效率也有助于得出第一個樣品的模板量更少的結(jié)論。然而,如果產(chǎn)生兩個 Ct值使用的是不同的儀器、試劑、引物和探針或反應體積,該結(jié)論就不成立。因此,只有在使用上文定義的相同反應條件來比較實驗時,Ct 絕對值的比較才有意義。

    圖 5.C隨 PCR 效率發(fā)生變化。藍色標準曲線的效率為 100%(斜率為 –3.3)。綠色標準曲線的效率為 78%(斜率為 –4)。與高效率條件相比(藍色),在低效率條件下(綠色),擴增量 Y 使 Ct 出現(xiàn)得更早。較低擴增量 (X) 時則情況相反,與高效率條件(藍色)相比,低效率條件(綠色)使 Ct 出現(xiàn)得更晚。

    如何評估實時熒光定量 PCR 反應的性能

    為了比較不同條件(例如兩種不同的預混液或兩臺不同的儀器)下的兩個反應,必須評估以下參數(shù)。

    動態(tài)范圍

    為了正確地評估 PCR 效率,至少需要 3 次重復和至少 5 個數(shù)量級倍數(shù)的模板濃度。圖 6 說了建議此精確級別的理由,它證明在 1 個數(shù)量級倍數(shù)與 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi)測試稀釋模板時,獲得的斜率或效率可能產(chǎn)生數(shù)學偏差。因此,即使檢測 100% 有效,由于每個稀釋點都存在標準差,檢測一個數(shù)量級倍數(shù)的連續(xù)稀釋時,可能獲得 70 至 170% 的范圍。在 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi)做相同數(shù)量的稀釋點或重復,可能的偏移只有 ±8%。這意味著在 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi),如果效率為 94%,則該實驗的效率范圍介于 88% 到 100% 之間。為了準確測定 PCR 反應的效率,必須進行 5 個數(shù)量級倍數(shù)的連續(xù)稀釋。-3.3 ±10% 的斜率意味著效率達到 100% ±±10%。PCR 反應效率越低,那么靈敏度越低。

    R2 值

    另一個評估 PCR 效率的關鍵參數(shù)是 R2,它是說明如何使用一個數(shù)值預測另一個數(shù)值的相關程度的統(tǒng)計學術語。如果 R2 為 1,那么 Y 值 (Ct) 可以用來準確預測 X 值(圖7A)。如果 R2 為 0,那么就不能通過 Y 值預測 X 值(圖 7B)。R2 值 >0.99 表示兩個數(shù)值之間相關的置信度良好。

    精確度

    標準差(偏差的平方根)是最常用的精確度計量方法。如果許多數(shù)據(jù)點都靠近平均值,則標準差就??;如果許多數(shù)據(jù)點都遠離平均值,則標準差就大。

    實際上,足夠多重復次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)集會形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)??赏ㄟ^經(jīng)典的中心極限定理來證明,該定理稱大量獨立同分布隨機變量的和在無限多時趨向于正態(tài)分布。如圖 8A 所示,約 68% 的值在平均值的 1 個標準差之內(nèi),約 95% 的值在平均值的 2 個標準差之內(nèi),約 99.7% 的值在平均值的 3 個標準差之內(nèi)。

    如果 PCR 效率為 100%,那么 2 倍稀釋時兩個連續(xù)濃度之間的 Ct 差為1(圖 8B)。要在 99.7% 以上的情況下定量 2 倍稀釋,標準差必須 ≤0.167。標準差越大,分辨 2 倍稀釋的能力就越低。要在 95% 以上的情況下區(qū)別 2 倍稀釋,標準差必須 ≤0.250(圖 8C)。

    靈敏度

    無論 Ct 絕對值是多少,任何能夠有效擴增和檢測起始模板拷貝數(shù)為 1 的系統(tǒng)都達到了靈敏度的極限。

    如前文所述,效率是決定反應靈敏度的關鍵因素(圖 5)。在檢測極低拷貝數(shù)時的另一個重要的考慮因素是,不能預期模板為正態(tài)分布。相反,它會遵循泊松分布,該分布預測在平均包含一個拷貝的起始模板的大量重復中,實際上約 37% 不含拷貝,僅有約 37% 含有 1 個拷貝,18% 應包含 2 個拷貝(見圖 9)。因此,為了可靠地檢測低拷貝,必須做大量的重復實驗來提供統(tǒng)計顯著性,以克服泊松分布的限制。

    圖 6.  準確計算 PCR 效率取決于連續(xù)稀釋所用模板量的范圍。對于具有 5 個稀釋點的 2 倍稀釋(橙色)而言,其可能的偏移高于具有 5 個稀釋點的 10 倍稀釋(藍色)。

     

    圖 7.為 2 條直線計算出 R2 值的示例。(A) x 和 y 值直接相關。(B) x 和 y 值無關。

    圖 8.正態(tài)分布和標準差。(A) 已顯示數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。PCR 效率為 100% 時,2 倍連續(xù)稀釋中的兩個連續(xù)樣品的平均值之間的 Ct 之差為1(樣品 X 和樣品 Y)。(B) 為了能夠在 99.7% 的情況下為兩個樣品定量,標準差必須低于 1 個 C除以 6 個標準差的值 (1/6 = 0.167)。(C) 為了能夠在 95% 的情況下為兩個樣品定量,標準差必須低于 1 個 C除以 4 個標準差的值 (1/4 = 0.25) 。

    圖 9.低拷貝數(shù)的泊松分布。藍色曲線代表 3.3 pg DNA(1 個 DNA 拷貝)的泊松分布。粉色曲線代表 6.6 pg DNA(1 個細胞,2 個 DNA 拷貝)的泊松分布。

    表1.實時熒光定量 PCR 的性能評估。

    因素建議標準
    效率5 個數(shù)量級倍數(shù)的連續(xù)稀釋斜率:~ –3.3R2 >0.99
    精確度最少 3 次重復標準差 <0.167
    靈敏度泊松分布導致低拷貝數(shù)樣品輸入需要重復多次反應統(tǒng)計檢驗分析

    結(jié)論

    比較不同的反應條件時,使用效率、R2、精確度和靈敏度來確定 PCR 反應的性能。為了精確嚴謹?shù)卦u估,表 1 中所列的所有因素都必須評估。除了這些因素,還必須評估和驗證合適的實驗對照(比如無模板對照、無 RT 對照)及模板質(zhì)量。


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