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檢驗檢測

實時熒光定量 PCR、數字 PCR 與傳統 PCR 對比

瀏覽量： 1795 發表時間： 2021-08-02 09:23

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簡介

實時熒光定量 PCR、傳統 PCR 與數字 PCR 概述

	數字 PCR	實時熒光定量 PCR	傳統 PCR
概述	測量陰性平行樣的比例以確定絕對拷貝數。	在發生 PCR 擴增時進行測量。	在 PCR 循環結束時測量積聚的 PCR 產物的量。
定量？	是，陰性 RCR 反應的比例適合泊松統計算法。	是，因為在 PCR 的指數（對數）期內采集數據，在此期間 PCR 產物的數量與核酸模板的量成正比。	否，但是比較凝膠上的擴增條帶的強度與已知濃度的標準品可為您提供“半定量”結果。
應用	病毒載荷絕對定量核酸標準品絕對定量下一代測序文庫絕對定量稀有等位基因檢測基因表達絕對定量混合物富集和分離	基因表達定量芯片驗證質量控制和檢測驗證病原體檢測 SNP 基因分型拷貝數變異 microRNA 分析病毒定量 siRNA/RNAi 實驗	DNA 擴增用于：測序基因分型分子克隆
總結	數字 PCR 的優點：無需依賴參考物或標準品通過增加 PCR 平行樣的總數可實現所需的精度高度耐受抑制劑能夠分析復雜混合物與傳統 qPCR 不同，數字 PCR 對出現的拷貝數呈線性反應，可以檢測到較小倍數變化的差異。	實時熒光定量 PCR 的優點：提高檢測的動態范圍無需 PCR 后處理檢測能夠覆蓋低至 2 倍的變化在 PCR 的指數期內采集數據報告基團熒光信號的增加與生成的擴增子數量成正比裂解探針提供擴增子的永久裂解記錄	傳統 PCR 的缺點：精確度差靈敏度低動態范圍小 < 2 logs 分辨率低非自動化僅限基于規格的區別分析結果未表示為數字使用溴化乙錠染色不足以定量 PCR 后處理

要了解為什么傳統 PCR 存在限制，務必要了解 PCR 反應過程中發生了什么?；?PCR 運行可以分為三個階段：

指數期

每個循環積聚的產物準確加倍（假定 100% 反應效率）。該反應具有高度特異性和精確度。出現指數式擴增，因為所有試劑均新鮮可用，反應的動力學推動反應有利于擴增子加倍。

線性期（高變異性）

隨著反應繼續，一些試劑因擴增而被消耗。反應開始減緩，并且每個循環的 PCR 產物不再加倍。

平臺期（終點：使用傳統方法進行凝膠檢測）

反應停止，不再產生更多產物，并且如果放置時間夠長，PCR 產物將開始降解。因為每個樣品具有不同的反應動力學，所以每支試管或每個反應將在不同的時間點進入平臺期。在平臺期可以看到這些差異。在平臺期內，傳統 PCR 進行測量，又稱為終點檢測。

圖 1：PCR 各階段。

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傳統 PCR 在平臺期測量時結果存在變異

在圖 2 中，三個復制樣品在反應開始時具有相同量的 DNA，在反應的平臺期具有不同量的 PCR 產物（反應動力學變化所致）。因此，在指數期內進行測量將更加精確，在該階段復制樣品呈指數式擴增。

圖 2：到 PCR 的平臺期，相同樣品將產生不同量的反應產物。

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實時熒光定量 PCR 在指數期測量可實現更加準確的定量

實時熒光定量 PCR 集中于指數期，因為它可提供更加精確的數據進行定量。在指數期內，實時熒光定量 PCR 儀器計算兩個數值。閾值線是反應的熒光強度超過背景時的檢測水平。樣品達到此水平的 PCR 循環稱為循環閾值 (Ct)。Ct 值用于下游定量或存在/缺失檢測。通過比較未知濃度的樣品與一系列標準品的 Ct 值，可以精確測定未知反應中的模板 DNA 數量。