要了解為什么傳統(tǒng) PCR 存在限制，務必要了解 PCR 反應過程中發(fā)生了什么?；?PCR 運行可以分為三個階段：

指數(shù)期

每個循環(huán)積聚的產(chǎn)物準確加倍（假定 100% 反應效率）。該反應具有高度特異性和精確度。出現(xiàn)指數(shù)式擴增，因為所有試劑均新鮮可用，反應的動力學推動反應有利于擴增子加倍。

線性期（高變異性）

隨著反應繼續(xù)，一些試劑因擴增而被消耗。反應開始減緩，并且每個循環(huán)的 PCR 產(chǎn)物不再加倍。

平臺期（終點：使用傳統(tǒng)方法進行凝膠檢測）

反應停止，不再產(chǎn)生更多產(chǎn)物，并且如果放置時間夠長，PCR 產(chǎn)物將開始降解。因為每個樣品具有不同的反應動力學，所以每支試管或每個反應將在不同的時間點進入平臺期。在平臺期可以看到這些差異。在平臺期內(nèi)，傳統(tǒng) PCR 進行測量，又稱為終點檢測。

 圖 1：PCR 各階段。

在圖 2 中，三個復制樣品在反應開始時具有相同量的 DNA，在反應的平臺期具有不同量的 PCR 產(chǎn)物（反應動力學變化所致）。因此，在指數(shù)期內(nèi)進行測量將更加精確，在該階段復制樣品呈指數(shù)式擴增。

圖 2：到 PCR 的平臺期，相同樣品將產(chǎn)生不同量的反應產(chǎn)物。

實時熒光定量 PCR 集中于指數(shù)期，因為它可提供更加精確的數(shù)據(jù)進行定量。在指數(shù)期內(nèi)，實時熒光定量 PCR 儀器計算兩個數(shù)值。閾值線是反應的熒光強度超過背景時的檢測水平。樣品達到此水平的 PCR 循環(huán)稱為循環(huán)閾值 (Ct)。Ct 值用于下游定量或存在/缺失檢測。通過比較未知濃度的樣品與一系列標準品的 Ct 值，可以精確測定未知反應中的模板 DNA 數(shù)量。

圖3：樣品熒光強度超過背景的 PCR 循環(huán)稱為循環(huán)閾值或 Ct。

數(shù)字 PCR 的工作原理在于將樣品分割到許多單獨的實時熒光定量 PCR 反應中；這些反應部分包含了目標分子（陽性），而其他不包含（陰性）。PCR 分析后，一部分陰性結(jié)果用于生成樣品中目標分子精確數(shù)量的絕對結(jié)果，而無需參考標準品或內(nèi)源性對照品。

圖4：  數(shù)字 PCR 使用陽性（黑色）與陰性（白色）PCR 反應的比例來計算目標分子的數(shù)量。

每個實時熒光定量 PCR 反應包括一個熒光報告基團分子——Applied Biosystems? TaqMan? 探針或 SYBR? Green 染料，例如用于監(jiān)測 PCR 產(chǎn)物積聚。隨著靶標擴增子數(shù)量增加，熒光基團發(fā)出的熒光量也隨之增加。

圖5：  實時熒光定量 PCR 與傳統(tǒng) PCR 的優(yōu)點

Applied Biosystems 提供齊全的產(chǎn)品用于基于實時熒光定量 PCR 的基因表達、miRNA、拷貝數(shù)變異和 SNP 基因分型分析，涵蓋從現(xiàn)成的基因特異性探針和引物組，到日常使用的試劑和塑料器具、儀器系統(tǒng)、軟件和這兩者之間的所有產(chǎn)品。