要了解為什么傳統(tǒng) PCR 存在限制，務(wù)必要了解 PCR 反應(yīng)過程中發(fā)生了什么?；?PCR 運(yùn)行可以分為三個(gè)階段：

指數(shù)期

每個(gè)循環(huán)積聚的產(chǎn)物準(zhǔn)確加倍（假定 100% 反應(yīng)效率）。該反應(yīng)具有高度特異性和精確度。出現(xiàn)指數(shù)式擴(kuò)增，因?yàn)樗性噭┚迈r可用，反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)推動(dòng)反應(yīng)有利于擴(kuò)增子加倍。

線性期（高變異性）

隨著反應(yīng)繼續(xù)，一些試劑因擴(kuò)增而被消耗。反應(yīng)開始減緩，并且每個(gè)循環(huán)的 PCR 產(chǎn)物不再加倍。

平臺(tái)期（終點(diǎn)：使用傳統(tǒng)方法進(jìn)行凝膠檢測(cè)）

反應(yīng)停止，不再產(chǎn)生更多產(chǎn)物，并且如果放置時(shí)間夠長(zhǎng)，PCR 產(chǎn)物將開始降解。因?yàn)槊總€(gè)樣品具有不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，所以每支試管或每個(gè)反應(yīng)將在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入平臺(tái)期。在平臺(tái)期可以看到這些差異。在平臺(tái)期內(nèi)，傳統(tǒng) PCR 進(jìn)行測(cè)量，又稱為終點(diǎn)檢測(cè)。

 圖 1：PCR 各階段。

在圖 2 中，三個(gè)復(fù)制樣品在反應(yīng)開始時(shí)具有相同量的 DNA，在反應(yīng)的平臺(tái)期具有不同量的 PCR 產(chǎn)物（反應(yīng)動(dòng)力學(xué)變化所致）。因此，在指數(shù)期內(nèi)進(jìn)行測(cè)量將更加精確，在該階段復(fù)制樣品呈指數(shù)式擴(kuò)增。

圖 2：到 PCR 的平臺(tái)期，相同樣品將產(chǎn)生不同量的反應(yīng)產(chǎn)物。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 集中于指數(shù)期，因?yàn)樗商峁└泳_的數(shù)據(jù)進(jìn)行定量。在指數(shù)期內(nèi)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀器計(jì)算兩個(gè)數(shù)值。閾值線是反應(yīng)的熒光強(qiáng)度超過背景時(shí)的檢測(cè)水平。樣品達(dá)到此水平的 PCR 循環(huán)稱為循環(huán)閾值 (Ct)。Ct 值用于下游定量或存在/缺失檢測(cè)。通過比較未知濃度的樣品與一系列標(biāo)準(zhǔn)品的 Ct 值，可以精確測(cè)定未知反應(yīng)中的模板 DNA 數(shù)量。

圖3：樣品熒光強(qiáng)度超過背景的 PCR 循環(huán)稱為循環(huán)閾值或 Ct。

數(shù)字 PCR 的工作原理在于將樣品分割到許多單獨(dú)的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)中；這些反應(yīng)部分包含了目標(biāo)分子（陽性），而其他不包含（陰性）。PCR 分析后，一部分陰性結(jié)果用于生成樣品中目標(biāo)分子精確數(shù)量的絕對(duì)結(jié)果，而無需參考標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)源性對(duì)照品。

圖4：  數(shù)字 PCR 使用陽性（黑色）與陰性（白色）PCR 反應(yīng)的比例來計(jì)算目標(biāo)分子的數(shù)量。

每個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)包括一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)分子——Applied Biosystems? TaqMan? 探針或 SYBR? Green 染料，例如用于監(jiān)測(cè) PCR 產(chǎn)物積聚。隨著靶標(biāo)擴(kuò)增子數(shù)量增加，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光量也隨之增加。

圖5：  實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 與傳統(tǒng) PCR 的優(yōu)點(diǎn)

Applied Biosystems 提供齊全的產(chǎn)品用于基于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的基因表達(dá)、miRNA、拷貝數(shù)變異和 SNP 基因分型分析，涵蓋從現(xiàn)成的基因特異性探針和引物組，到日常使用的試劑和塑料器具、儀器系統(tǒng)、軟件和這兩者之間的所有產(chǎn)品。