實時熒光定量 PCR，又稱為定量 PCR 或 qPCR，可以為測定樣品中的靶標(biāo)序列或基因數(shù)量提供簡單、簡潔的方法。該方法高度簡化，有時會忽略實現(xiàn)方法方面的關(guān)鍵因素，因此導(dǎo)致出現(xiàn)問題。本文將重點強(qiáng)調(diào)設(shè)置和評估實時熒光定量 PCR 反應(yīng)時必須考慮的這些因素。

可能影響 Ct 的因素

Ct（閾值循環(huán)）是擴(kuò)增曲線與閾值線的交叉點（圖 1B）。它是 PCR 反應(yīng)中靶標(biāo)濃度的相對測量。除靶標(biāo)濃度之外，還有很多因素會影響 Ct 的絕對值。我們將要討論最常見的可能影響 Ct 值的非模板依賴性因素，并描述如何評估實時熒光定量 PCR 反應(yīng)的性能。

上述圖 1 顯示實時反應(yīng)擴(kuò)增圖的幾個參數(shù)。圖 1B 中的指數(shù)期對應(yīng)于圖 1C 中的線性期。在圖 1C 中，閾值必須設(shè)在擴(kuò)增圖的線性期中。Ct 值隨模板量減少而增加。然而，反應(yīng)混合物或儀器中的任何干擾，只要能影響與 Ct 計算相關(guān)的熒光測定，都會使 Ct 值產(chǎn)生非模板依賴性的變化。因此，在不同條件下或用不同試劑進(jìn)行的 PCR 反應(yīng)產(chǎn)生的 Ct 值不可以直接進(jìn)行比較。 

圖 2.  在使用具有相同 ROX 水平的兩種預(yù)混液的一次檢測中獲得的原始熒光數(shù)據(jù)。信號差異是由預(yù)混液的成分造成的。使用 Applied Biosystems? VIC?/MGB 探針在 Applied Biosystems? 7900HT 快速實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)上執(zhí)行此反應(yīng)。x 軸顯示熒光基團(tuán)的的發(fā)射波長，y 軸顯示發(fā)射強(qiáng)度。

任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素的影響，比如溶液的 pH 值和鹽濃度。圖 2 顯示某個 Applied Biosystems? TaqMan? 探針在兩種不同預(yù)混液背景下的原始熒光數(shù)據(jù)。請注意，盡管兩組反應(yīng)的靶標(biāo)、探針和 ROX 染料濃度都相同，預(yù)混液 A 中的熒光強(qiáng)度更高。

因此，如圖 3 所示，產(chǎn)生的 ΔRn 值也不同。請注意，熒光信號基線屬于非模板依賴性因素，兩種預(yù)混液的基線是不同的（圖 3A）。Ct 值的變化并沒有反映出反應(yīng)系統(tǒng)的整體性能（圖 3B）。靈敏度相當(dāng)?shù)念A(yù)混液產(chǎn)生的 Ct 絕對值可能不同。

圖 3.使用預(yù)混液 A 和預(yù)混液 B 在等量的人類 gDNA 中進(jìn)行 RNase P 擴(kuò)增。(A) Rn 根據(jù)循環(huán)數(shù)進(jìn)行繪制，并且顯示兩個反應(yīng)的基線。(B) 對數(shù) (ΔRn) 根據(jù)循環(huán)數(shù)進(jìn)行繪制。兩種預(yù)混液的閾值（綠線）設(shè)定為相同水平。對于相同濃度的靶標(biāo)而言，預(yù)混液 B 的 Ct 值 (CtB) 早于預(yù)混液 A 的相應(yīng)值 (CtA)，表明預(yù)混液 B 的基線較低。使用 Applied Biosystems? 7500 實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)執(zhí)行所有擴(kuò)增。

Rn 值是由 Applied Biosystems? FAM? 染料的熒光除以 ROX 染料的熒光而計算得出的比率。因此，假定 FAM 染料產(chǎn)生的熒光信號保持不變，ROX 染料量越少，產(chǎn)生的 Rn 值就越高。這將導(dǎo)致 Rn 基線上升，以及隨后 ΔRn 的減少和 Ct 值的變化。通過降低 ROX 染料水平而得到不同 Ct 值，沒有對反應(yīng)的真實靈敏度產(chǎn)生任何影響，卻有著意想不到的后果。如圖 4 所示，降低 ROX 染料的濃度可能會增加 Ct 值的標(biāo)準(zhǔn)差。標(biāo)準(zhǔn)差越大，分辨靶濃度之間的細(xì)微區(qū)別的可信度就越低（參加下文的精確度一節(jié)）。

圖 4.  使用包含 3 種不同濃度的 ROX 染料的預(yù)混液對 TGF-β 進(jìn)行擴(kuò)增。顯示 (A) Ct 值和 (B) 標(biāo)準(zhǔn)差隨 ROX 染料濃度的變化。降低 ROX 染料濃度導(dǎo)致 Ct 出現(xiàn)得更早，但是會增大標(biāo)準(zhǔn)差。使用 Applied Biosystems 7500 實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)執(zhí)行所有擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)的效率也會影響 Ct 值。在低效率條件下進(jìn)行連續(xù)稀釋擴(kuò)增，與高效率條件下相比，可能會產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖 5 中，兩個樣品（X 和 Y）分別在低效率和高效率條件下擴(kuò)增，在靶濃度相同的條件下得到了不同的 Ct 值。在此示例中，盡管高效率條件（圖 5 中的藍(lán)色曲線）在高濃度時產(chǎn)生的 Ct 值更晚，但它在靶濃度低時卻更為靈敏。PCR 效率取決于實驗、預(yù)混液性能和樣品質(zhì)量。通常情況下，反應(yīng)效率在 90-110% 之間都是可以接受的。另一方面，假定所有其他因素如儀器、試劑和實驗完全相同， 該效率也有助于得出第一個樣品的模板量更少的結(jié)論。然而，如果產(chǎn)生兩個 Ct值使用的是不同的儀器、試劑、引物和探針或反應(yīng)體積，該結(jié)論就不成立。因此，只有在使用上文定義的相同反應(yīng)條件來比較實驗時，Ct 絕對值的比較才有意義。

圖 5.Ct 隨 PCR 效率發(fā)生變化。藍(lán)色標(biāo)準(zhǔn)曲線的效率為 100%（斜率為 –3.3）。綠色標(biāo)準(zhǔn)曲線的效率為 78%（斜率為 –4）。與高效率條件相比（藍(lán)色），在低效率條件下（綠色），擴(kuò)增量 Y 使 Ct 出現(xiàn)得更早。較低擴(kuò)增量 (X) 時則情況相反，與高效率條件（藍(lán)色）相比，低效率條件（綠色）使 Ct 出現(xiàn)得更晚。

為了比較不同條件（例如兩種不同的預(yù)混液或兩臺不同的儀器）下的兩個反應(yīng)，必須評估以下參數(shù)。

動態(tài)范圍

為了正確地評估 PCR 效率，至少需要 3 次重復(fù)和至少 5 個數(shù)量級倍數(shù)的模板濃度。圖 6 說了建議此精確級別的理由，它證明在 1 個數(shù)量級倍數(shù)與 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi)測試稀釋模板時，獲得的斜率或效率可能產(chǎn)生數(shù)學(xué)偏差。因此，即使檢測 100% 有效，由于每個稀釋點都存在標(biāo)準(zhǔn)差，檢測一個數(shù)量級倍數(shù)的連續(xù)稀釋時，可能獲得 70 至 170% 的范圍。在 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi)做相同數(shù)量的稀釋點或重復(fù)，可能的偏移只有 ±8%。這意味著在 5 個數(shù)量級倍數(shù)范圍內(nèi)，如果效率為 94%，則該實驗的效率范圍介于 88% 到 100% 之間。為了準(zhǔn)確測定 PCR 反應(yīng)的效率，必須進(jìn)行 5 個數(shù)量級倍數(shù)的連續(xù)稀釋。-3.3 ±10% 的斜率意味著效率達(dá)到 100% ±±10%。PCR 反應(yīng)效率越低，那么靈敏度越低。

R2 值

另一個評估 PCR 效率的關(guān)鍵參數(shù)是 R2，它是說明如何使用一個數(shù)值預(yù)測另一個數(shù)值的相關(guān)程度的統(tǒng)計學(xué)術(shù)語。如果 R2 為 1，那么 Y 值 (Ct) 可以用來準(zhǔn)確預(yù)測 X 值（圖7A）。如果 R2 為 0，那么就不能通過 Y 值預(yù)測 X 值（圖 7B）。R2 值 >0.99 表示兩個數(shù)值之間相關(guān)的置信度良好。

精確度

標(biāo)準(zhǔn)差（偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數(shù)據(jù)點都靠近平均值，則標(biāo)準(zhǔn)差就??；如果許多數(shù)據(jù)點都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)差就大。

實際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)集會形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)?？赏ㄟ^經(jīng)典的中心極限定理來證明，該定理稱大量獨立同分布隨機(jī)變量的和在無限多時趨向于正態(tài)分布。如圖 8A 所示，約 68% 的值在平均值的 1 個標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)，約 95% 的值在平均值的 2 個標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)，約 99.7% 的值在平均值的 3 個標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)。

如果 PCR 效率為 100%，那么 2 倍稀釋時兩個連續(xù)濃度之間的 Ct 差為1（圖 8B）。要在 99.7% 以上的情況下定量 2 倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)差必須 ≤0.167。標(biāo)準(zhǔn)差越大，分辨 2 倍稀釋的能力就越低。要在 95% 以上的情況下區(qū)別 2 倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)差必須 ≤0.250（圖 8C）。

靈敏度

無論 Ct 絕對值是多少，任何能夠有效擴(kuò)增和檢測起始模板拷貝數(shù)為 1 的系統(tǒng)都達(dá)到了靈敏度的極限。

如前文所述，效率是決定反應(yīng)靈敏度的關(guān)鍵因素（圖 5）。在檢測極低拷貝數(shù)時的另一個重要的考慮因素是，不能預(yù)期模板為正態(tài)分布。相反，它會遵循泊松分布，該分布預(yù)測在平均包含一個拷貝的起始模板的大量重復(fù)中，實際上約 37% 不含拷貝，僅有約 37% 含有 1 個拷貝，18% 應(yīng)包含 2 個拷貝（見圖 9）。因此，為了可靠地檢測低拷貝，必須做大量的重復(fù)實驗來提供統(tǒng)計顯著性，以克服泊松分布的限制。

圖 6.  準(zhǔn)確計算 PCR 效率取決于連續(xù)稀釋所用模板量的范圍。對于具有 5 個稀釋點的 2 倍稀釋（橙色）而言，其可能的偏移高于具有 5 個稀釋點的 10 倍稀釋（藍(lán)色）。

圖 7.為 2 條直線計算出 R2 值的示例。(A) x 和 y 值直接相關(guān)。(B) x 和 y 值無關(guān)。

圖 8.正態(tài)分布和標(biāo)準(zhǔn)差。(A) 已顯示數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。PCR 效率為 100% 時，2 倍連續(xù)稀釋中的兩個連續(xù)樣品的平均值之間的 Ct 之差為1（樣品 X 和樣品 Y）。(B) 為了能夠在 99.7% 的情況下為兩個樣品定量，標(biāo)準(zhǔn)差必須低于 1 個 Ct 除以 6 個標(biāo)準(zhǔn)差的值 (1/6 = 0.167)。(C) 為了能夠在 95% 的情況下為兩個樣品定量，標(biāo)準(zhǔn)差必須低于 1 個 Ct 除以 4 個標(biāo)準(zhǔn)差的值 (1/4 = 0.25) 。

圖 9.低拷貝數(shù)的泊松分布。藍(lán)色曲線代表 3.3 pg DNA（1 個 DNA 拷貝）的泊松分布。粉色曲線代表 6.6 pg DNA（1 個細(xì)胞，2 個 DNA 拷貝）的泊松分布。

比較不同的反應(yīng)條件時，使用效率、R2、精確度和靈敏度來確定 PCR 反應(yīng)的性能。為了精確嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卦u估，表 1 中所列的所有因素都必須評估。除了這些因素，還必須評估和驗證合適的實驗對照（比如無模板對照、無 RT 對照）及模板質(zhì)量。