核酸檢測(cè)作為新冠肺炎感染者的確診依據(jù)，在疫情防控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。“內(nèi)標(biāo)”基因作為體現(xiàn)核酸檢測(cè)質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，通常指實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的內(nèi)參基因，能夠?qū)蝹€(gè)待測(cè)樣本本身的檢測(cè)環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可作為質(zhì)控品的有力補(bǔ)充。

目前獲批的核酸檢測(cè)試劑盒基本都已經(jīng)加入“內(nèi)標(biāo)”，主要分為“外源性內(nèi)標(biāo)”和“內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)”兩種，下面我們結(jié)合實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常遇到的“樣本內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增異常”情況，與大家討論一下，在質(zhì)控滿足要求時(shí)，如何正確的認(rèn)識(shí)核酸檢測(cè)中的內(nèi)標(biāo)基因。

常見(jiàn)原因：無(wú)法明確是否存在檢驗(yàn)前問(wèn)題，多數(shù)為檢驗(yàn)中內(nèi)標(biāo)樣本錯(cuò)加漏加、核酸加樣時(shí)錯(cuò)加漏加；若連續(xù)多個(gè)樣本存在此情況，首先考慮提取試劑、提取儀的問(wèn)題。

常見(jiàn)原因：應(yīng)先明確靶基因是否同內(nèi)標(biāo)基因存在競(jìng)爭(zhēng)或抑制作用，若不存在，原因同上，且該擴(kuò)增孔存在污染可能。

例圖1: 典型的高濃度樣本抑制內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增。

圖 1 靶基因有擴(kuò)增但內(nèi)標(biāo)無(wú)擴(kuò)增

常見(jiàn)原因：外源性內(nèi)標(biāo)最大特點(diǎn)為均勻性好，故個(gè)別樣本內(nèi)標(biāo)離散時(shí)多為反應(yīng)體系中存在抑制物；部分連續(xù)樣本內(nèi)標(biāo)離散時(shí)，應(yīng)首先考慮提取試劑、提取儀的問(wèn)題；若整板樣本內(nèi)標(biāo)離散時(shí)，多為擴(kuò)增體系配制時(shí)未充分混勻。

例圖2: 該樣本反應(yīng)體系中存在抑制物。

圖 2 單個(gè)樣本內(nèi)標(biāo)基因離散

例圖3: 由于磁珠殘留、加熱模塊異常，造成多個(gè)連續(xù)樣本內(nèi)標(biāo)基因離散。

圖 3 多個(gè)樣本內(nèi)標(biāo)基因離散

更換試劑、耗材、儀器等條件進(jìn)行復(fù)檢；重新采樣檢測(cè)并嚴(yán)格按照sop操作等。

內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)有擴(kuò)增不代表采樣成功，原因有3點(diǎn)：

1.對(duì)于混采樣本，只需1個(gè)受試者采樣成功，內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)就會(huì)有擴(kuò)增；

2.以RNase P內(nèi)標(biāo)為例，如不能正確采樣，僅采集口腔甚至皮膚樣本，同樣會(huì)有內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增；

3.環(huán)境中可能會(huì)存在人源性樣本氣溶膠污染。但是，采樣不成功時(shí)，內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)一定無(wú)擴(kuò)增。

常見(jiàn)原因：實(shí)驗(yàn)室較為常見(jiàn)，涉及范圍較廣，包括檢驗(yàn)前樣本采集、保存、運(yùn)送問(wèn)題；檢驗(yàn)中反應(yīng)體系、提取、擴(kuò)增問(wèn)題以及人員操作問(wèn)題等。

常見(jiàn)原因：情況極其少見(jiàn)，因內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)基因與靶基因通常無(wú)競(jìng)爭(zhēng)或抑制作用，所以原因同上，且該擴(kuò)增孔可能存在污染或非特異性擴(kuò)增。

例圖4: 采樣失敗且靶基因非特異性擴(kuò)增。

圖 4 靶基因非特異性擴(kuò)增且內(nèi)標(biāo)無(wú)擴(kuò)增

常見(jiàn)原因：由于采樣質(zhì)量直接影響內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增結(jié)果，故曲線較離散屬于正常情況，并不一定是人員不規(guī)范操作引起的，所以這種情況較難界定。

例圖5: 若排除檢驗(yàn)前問(wèn)題，整體內(nèi)標(biāo)曲線相對(duì)離散，可能由于樣本未充分振蕩混勻或擴(kuò)增體系配制時(shí)未充分振蕩混勻。

圖 5內(nèi)標(biāo)基因離散

更換試劑、耗材、儀器等條件進(jìn)行復(fù)檢；重新采樣檢測(cè)并嚴(yán)格按照sop操作等。

常見(jiàn)原因：

1.可能是提取儀異常導(dǎo)致提取效率低，多為加熱模塊故障、磁珠異?；虼胖闅埩簦?/strong>

2.可能所用的反應(yīng)液放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降；

3.可能是不同的采樣管內(nèi)的保存液對(duì)提取試劑的提取效率有影響。

圖 6 擴(kuò)增曲線分為兩簇

常見(jiàn)原因：多為錯(cuò)用擴(kuò)增程序，如A試劑反應(yīng)體系使用了B試劑的擴(kuò)增程序，可重新選擇正確的熒光通道。

圖 7 內(nèi)標(biāo)曲線不平滑

不同的內(nèi)標(biāo)都各有利弊，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)具體的使用需求，科學(xué)看待和選擇。即“有內(nèi)標(biāo)不一定行，但無(wú)內(nèi)標(biāo)一定不行”。

核酸檢測(cè)過(guò)程中的每一個(gè)操作環(huán)節(jié)都有可能影響檢測(cè)結(jié)果，所以實(shí)驗(yàn)室必須規(guī)范化管理，出現(xiàn)樣本內(nèi)標(biāo)異常結(jié)果時(shí)也應(yīng)細(xì)心觀察、耐心分析，采樣人員采樣時(shí)也應(yīng)規(guī)范合理，最終保證核酸檢測(cè)的質(zhì)量，為疫情防控保駕護(hù)航。